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　　【专利摘要】本专利技术涉及检测NK细胞活性的方法。该方法为：利用转染技术使靶细胞特异性表达荧光蛋白，得到转染靶细胞；将待测NK细胞与转染靶细胞共孵育，得到第一混合细胞液；向第一混合细胞液中加入第一荧光染料，孵育，得到第二混合细胞液；向第二混合细胞液中加入第二荧光染料，混合，得到第三混合细胞液；利用流式细胞仪检测所述第三混合细胞液，得到活的、早期凋亡的、晚期凋亡的、以及死亡的靶细胞的细胞数比例；其中，第一荧光染料为荧光素标记的磷脂结合蛋白，第二荧光染料为核酸染料，并且荧光蛋白、第一荧光染料和第二荧光染料的发射波长互不相同。本专利技术的检测NK细胞活性的方法，可以更加全面地反映NK细胞的活性。【专利说明】检测NK细胞活性的方法

　　自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)是机体天然免疫系统中重要的效应细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染有关，并且具有免疫调节功能，在某些情况下参与超敏反应及自身免疫疾病的发生。NK细胞活性的检测是医学研究或临床研究中的一项重要工作。针对NK细胞活性的检测，目前已先后研究出多种检测方法,例如51Cr释放法、乳酸脱氢酶(LDH)释放法、噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞术法等。其中，流式细胞术法由于具有无放射性污染、稳定性高等优点，因此得到越来越广泛的关注。相关技术中，流式细胞术法检测NK细胞活性常用的手段是:首先通过瞬时转染使靶细胞特异性表达绿色荧光蛋白(GFP);然后共孵育靶细胞和NK细胞；孵育一段时间后再使用碘化丙啶(PI)标记死亡细胞；最后检测活的靶细胞的荧光强度和死亡的靶细胞的荧光强度，根据两者的比值得到NK细胞的活性。这种检测方法主要存在以下缺点:PI是一种核酸荧光染料，仅能标记细胞膜失去完整性的晚期凋亡细胞及死亡细胞，因此上述检测方法无法反映NK细胞对靶细胞杀伤过程中所致细胞早期凋亡(此时细胞膜完整性仍然存在)的比例。

　　本专利技术的目的在于提供检测NK细胞活性的方法，以解决上述的问题。在本专利技术的实施例中提供了检测NK细胞活性的方法，包括下列步骤:利用转染技术使靶细胞特异性表达荧光蛋白，得到转染靶细胞；将待测NK细胞与转染靶细胞共孵育，得到第一混合细胞液；向第一混合细胞液中加入第一荧光染料，孵育，得到第二混合细胞液；向第二混合细胞液中加入第二荧光染料，混合，得到第三混合细胞液；利用流式细胞仪检测第三混合细胞液，得到活的靶细胞的细胞数比例，早期凋亡的靶细胞的细胞数比例，晚期凋亡的靶细胞的细胞数比例以及死亡靶细胞的细胞数比例；其中，第一荧光染料为荧光素标记的磷脂结合蛋白，第二荧光染料为核酸染料，并且荧光蛋白、第一荧光染料和第二荧光染料的发射波长互不相同。进一步地，转染技术为:构建表达荧光蛋白的慢病毒质粒载体，并包装形成慢病毒；用慢病毒侵染靶细胞，将目的基因整合到靶细胞的基因组中。进一步地，荧光蛋白为以下中的一种:绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白、红色荧光蛋白、橙色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或紫色荧光蛋白。进一步地，第一荧光染料中，荧光素为以下中的一种:藻红蛋白、异硫氰酸荧光素、增强型荧光蛋白、别藻蓝蛋白。进一步地，第二荧光染料为以下中的一种:7_氨基放线菌素D、碘化丙啶、溴化乙锭、吖啶橙、4，6- 二脒基-2-苯基吲哚或赫克斯特。进一步地，靶细胞为下中的一种:K-562细胞、海拉细胞或恶性黑色素瘤细胞系。本专利技术上述实施例的检测NK细胞活性的方法通过双染的方法实现了同时检测不同状态的靶细胞(即活的靶细胞、早期凋亡的靶细胞、晚期凋亡和死亡的靶细胞)的比例的目的，可以更加全面地反映NK细胞的活性。以上检测方法的具体原理是:首先通过转染技术使靶细胞特异性表达荧光蛋白，从而实现特异性识别靶细胞的目的，即若发出上述荧光蛋白的荧光则为靶细胞。其次，将待测NK细胞与转染靶细胞共孵育，发生特异性结合引起靶细胞凋亡。再向第一混合细胞液中加入第一荧光染料，使其特异性地与暴露在细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸(PS)结合；再向第二混合细胞液中加入第二荧光染料，使其特异性标记细胞结构完整性破坏的凋亡及死亡细胞的细胞核。由于在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中，因此早期凋亡的靶细胞能够被第一荧光染料显著染色。而在细胞凋亡的晚期，虽然细胞膜的破坏程度较大，但是还存在一定量的外翻的细胞膜，因此，晚期凋亡的靶细胞也能够被第一荧光染料染色，并且由于晚期凋亡的靶细胞膜的结构已不完整，因此，第二荧光染料(核酸染料)可以透过晚期凋亡的靶细胞膜进入细胞核内将细胞核染色。而死亡的靶细胞的细胞膜基本被完全破坏，因此几乎无法被第一荧光染料染色，但死亡靶细胞的核酸物质仍然存在，因此可以被第二荧光染料染色。由此可见，通过以上步骤达到以下目的:以步骤101中的荧光蛋白为绿色荧光蛋白为例，所有靶细胞发出绿色荧光；早期凋亡的靶细胞发出绿色荧光和第一荧光染料的荧光，对第二荧光染料拒染，不发出第二荧光染料的荧光；晚期凋亡的靶细胞可发出绿色荧光、第一荧光染料的荧光和第二荧光染料的荧光；死亡的靶细胞可发出绿色荧光和第二荧光染料的荧光。最后，结合以上四种状态的靶细胞的发光特点，利用流式细胞仪进行检测，即可得到活的靶细胞的细胞数比例，早期凋亡的靶细胞的细胞数比例，晚期凋亡的靶细胞的细胞数比例以及死亡的靶细胞的细胞数比例。【专利附图】【附图说明】图1示出了 GFP-K562细胞在IOX 10倍显微镜下的成像图；图2示出了 GFP-K562细胞在10X40倍显微镜下的成像图；图3示出了流式细胞仪测定的GFP-K562细胞GFP表达率的散点图；图4示出了流式细胞仪测定的GFP-K562细胞GFP表达率的峰值图；图5示出了流式细胞仪检测的单纯GFP-K562细胞自然凋亡比例分布图；图6示出了流式细胞仪检测的正常人的NK细胞对GFP-K562细胞的活性结果；图7示出了流式细胞仪检测的患者的NK细胞对GFP-K562细胞的活性结果。【具体实施方式】下面通过具体的实施例子并结合附图对本专利技术做进一步的详细描述。实施例一一种检测NK细胞活性的方法，包括下列步骤:步骤101:利用转染技术方法使靶细胞特异性表达荧光蛋白，得到转染靶细胞。步骤102:将待测NK细胞与转染靶细胞共孵育，得到第一混合细胞液。步骤103:向第一混合细胞液中加入第一荧光染料，孵育，得到第二混合细胞液。步骤104:向第二混合细胞液中加入第二荧光染料，混合，得到第三混合细胞液。步骤105:利用流式细胞仪检测第三混合细胞液，得到活的靶细胞的细胞数比例，早期凋亡的靶细胞的细胞数比例，晚期凋亡的靶细胞的细胞数比例以及死亡的靶细胞的细胞数比例。其中，第一荧光染料为荧光素标记的磷脂结合蛋白，第二荧光染料为核酸染料,并且荧光蛋白、第一荧光染料和第二荧光染料的发射波长互不相同。以上检测方法通过双染的方法实现了同时检测不同状态的靶细胞(即活的靶细胞、早期凋亡的靶细胞、晚期凋亡的靶细胞和死亡的靶细胞)的比例的目的，可以更加全面地反映NK细胞的活性。以上检测方法的具体原理是:首先通过细胞转染技术使靶细胞特异性表达荧光蛋白，从而实现特异性识别靶细胞的目的，即若发出上述荧光蛋

　　一种检测NK细胞活性的方法，其特征在于，包括下列步骤：利用转染技术使靶细胞特异性表达荧光蛋白，得到转染靶细胞；将待测NK细胞与所述转染靶细胞共孵育，得到第一混合细胞液；向所述第一混合细胞液中加入第一荧光染料，孵育，得到第二混合细胞液；向所述第二混合细胞液中加入第二荧光染料，混合，得到第三混合细胞液；利用流式细胞仪检测所述第三混合细胞液，得到活的靶细胞的细胞数比例，早期凋亡的靶细胞的细胞数比例，晚期凋亡的靶细胞的细胞数比例以及死亡的靶细胞的细胞数比例；其中，所述第一荧光染料为荧光素标记的磷脂结合蛋白，所述第二荧光染料为核酸染料，并且所述荧光蛋白、所述第一荧光染料和所述第二荧光染料的发射波长互不相同。