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　　1、NK细胞杀伤活性检测细胞杀伤活性检测 -乳酸脱氢酶释放法乳酸脱氢酶释放法 1 目的要求目的要求 熟悉乳酸脱氢酶释放法测定熟悉乳酸脱氢酶释放法测定NK细胞杀伤细胞杀伤活性的检测方法。活性的检测方法。2【原理】乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 (LDH)(LDH)是活细胞胞浆内含酶之一。是活细胞胞浆内含酶之一。正常情况下，正常情况下，LDHLDH不能透过细胞膜。当靶细胞受到不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDHLDH可释放至介质中。释放出来的可释放至介质中。释放出来的LDHLDH在催化乳酸生在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使成丙酮酸

　　2、的过程中，使氧化型辅酶氧化型辅酶(NAD+)(NAD+)变成变成还原型辅酶还原型辅酶(NADH2)(NADH2)。后者再通过递氢体。后者再通过递氢体-吩嗪二吩嗪二甲酯硫酸盐甲酯硫酸盐 (PMS)(PMS)还原硝基氯化四氮唑蓝还原硝基氯化四氮唑蓝(NBT)(NBT)，形成形成有色有色的甲臢类化合物，在的甲臢类化合物，在490nm490nm或或570nm570nm波长处波长处有一高吸收峰。利用读取的有一高吸收峰。利用读取的A A值，经过计算即可得值，经过计算即可得知知NKNK细胞杀伤靶细胞的活性。细胞杀伤靶细胞的活性。3 实验原理实验原理 效应细胞效应细胞 靶细胞靶细胞 释放释放LDH 丙酮酸丙酮

　　3、酸 乳酸乳酸 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(LDH)NAD+NADH+H+PMS NBT 甲臢甲臢(OD570nm）吩嗪二甲酯硫酸盐吩嗪二甲酯硫酸盐 硝基氯化四氮唑蓝硝基氯化四氮唑蓝 4【试剂】1.靶细胞靶细胞 检测人的检测人的NK 细胞活性常用的靶细胞为体细胞活性常用的靶细胞为体 外传代细胞株外传代细胞株K562。2.效应细胞效应细胞 从人外周血（肝素抗凝）分离的单个核从人外周血（肝素抗凝）分离的单个核 细胞。细胞。3.1640 培养液培养液 4.LDH 底物溶液（临用前配制）底物溶液（临用前配制）NBT 硝基氯化四氮唑蓝硝基氯化四氮唑蓝 4mg NAD+I 氧化型辅酶氧化型辅酶I 10mg PMS

　　4、 吩嗪二甲酯硫酸盐吩嗪二甲酯硫酸盐 1mg 5【试剂】加蒸馏水加蒸馏水2ml 溶解，混匀后取上清液溶解，混匀后取上清液1.6ml，加，加1mol/L 乳酸钠乳酸钠0.4ml，然后加入，然后加入0.1mol/L pH7.4 PBS 至至10ml。5.1%NP40：取取1ml NP-40 加去离子水加去离子水99ml。6.1mol/L 柠檬酸终止液柠檬酸终止液 取柠檬酸取柠檬酸21g 加去离子水加去离子水100ml 6 实验步骤实验步骤 效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）靶细胞的制备靶细胞的制备 效效-靶细胞相互作用靶细胞相互作用 酶促反应酶促反应 结果判

　　5、读结果判读 7 取培养取培养2448hr的靶细胞的靶细胞(K562),洗涤洗涤3次（次（1000rpm10min）,最后最后用完全用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓培养液调整细胞浓度至度至1105/ml,备用。备用。靶细胞的制备：靶细胞的制备：8 效应细胞的制备效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）（分离外周血单个核细胞）采集静脉血采集静脉血4 ml，加，加0.2ml肝素溶液（肝素溶液（125-250U/ml）抗凝）抗凝 分别吸取分别吸取2ml淋巴细胞分层液置淋巴细胞分层液置10ml离心管中，离心管中，将管倾斜将管倾斜45，沿管壁缓缓注入抗凝血，沿管壁缓缓注入抗凝血 离心离心2000rp

　　6、m20min 9 密度梯度离心分离淋巴细胞亚群密度梯度离心分离淋巴细胞亚群 10 用完全用完全RPMI-1640定容细胞，计数后调整细胞浓度定容细胞，计数后调整细胞浓度（加入（加入0.2ml完全完全RPMI-1640，混匀，混匀，1x 107）将所得将所得PBMC用用5倍体积的倍体积的1640洗涤一次洗涤一次 2000rpm10 min 用毛细吸管轻轻吸去上层的血浆、稀释液及血小板，用毛细吸管轻轻吸去上层的血浆、稀释液及血小板，再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞（灰白色层）再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞（灰白色层）11 计数计数PBMCPBMC 1.1.计数计数4 4个大方格中（即个大方格中（即6464个小方格）所有细个小方格）所有细胞数胞数 2.2.计数原则：数上不数下，数左不数右。计数原则：数上不数下，数左不数右。3.3.总数除以总数除以4 4，所得数据，所得数据10104 4即为即为1ml1ml液体中的液体中的细胞总数细胞总数 4.4.每每mlml健康成人血可分离出健康成人血可分离出1 110106 62 210106 6个个单个核细胞单个核细胞 12 13 计数计数PB